载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA是一种新的非病毒转基因载体。一、一个合格质粒的组成要素复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。原核生物DNA分子中只有一个复制起始点。而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。抗生素抗性基因 可以便于加以检测,如Amp+ ,Kan+多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段P/E 启动子/增强子Terms 终止信号加poly(A)信号 可以起到稳定mRNA作用二、如何阅读质粒图谱第一步:首先看Ori的位置,了解质粒的类型(原核/真核/穿梭质粒)第二步:再看筛选标记,如抗性,决定使用什么筛选标记。(1)Ampr 水解β-内酰胺环,解除氨苄的毒性。(2)tetr 可以阻止四环素进入细胞。(3)camr 生成氯霉素羟乙酰基衍生物,使之失去毒性。(4)neor(kanr) 氨基糖苷磷酸转移酶 使G418(长那霉素衍生物)失活(5)hygr 使潮霉素β失活。第三步:看多克隆位点(MCS)。它具有多个限制酶的单一切点。便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。第四步:再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。第五步:是否含有表达系统元件,即启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用那种载体,还是要以实验目的为准绳。启动子-核糖体结合位点-克隆位点-转录终止信号启动子-促进DNA转录的DNA顺序,这个DNA区域常在基因或操纵子编码顺序的上游,是DNA分子上可以与RNApol特异性结合并使之开始转录的部位,但启动子本身不被转录。增强子/沉默子-为真核基因组(包括真核病毒基因组)中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。/沉默子-负增强子,负调控序列。核糖体结合位点/起始密码/SD序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA有核糖体的两个结合位点,对于原核而言是AUG(起始密码)和SD序列。转录终止顺序(终止子)/翻译终止密码子:结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。结构基因的最后一个外显子中有一个AATAAA的保守序列,此位点down-stream有一段GT或T富丰区,这2部分共同构成poly(A)加尾信号。回答有人之前提出的一个问题:为什么质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针,那其实是代表两条DNA链,即质粒是环状双链DNA,它的启动子等在其中一条链上,而它的抗性基因在另一条链上.Approved三、介绍一下关于载体的知识(虽然课本上都有写)1.什么是载体即要把一个有用的基因(目的基因——研究或应用基因)通过基因工程手段送到生物细胞(受体细胞),需要运载工具(交通工具)携带外源基因进入受体细胞,这种运载工具就叫做载体(vector)。P.S.基因工程所用的vector实际上是DNA分子,是用来携带目的基因片段进入受体细胞的DNA2.载体的分类―――按功能分成:(1)克隆载体 都有一个松弛的复制子,能带动外源基因,在宿主细胞中复制扩增。它是用来克隆和扩增DNA片段(基因)的载体。(所以有时实验时扩增效率低下,要注意是不是使用的严谨行载体)(2)表达载体 具有克隆载体的基本元件(ori,Ampr,Mcs等)还具有转录/翻译所必需的DNA顺序的载体。―――按进入受体细胞类型分:(1)原核载体 (2)真核载体 (3)穿梭载体(sbuttle vector) 指在两种宿主生物体内复制的载体分子,因而可以运载目的基因(穿梭往返两种生物之间).P.S. 穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子,以确保两类细胞中都能扩增。3.基因工程载体的3个特点:(一)都能独立自主的复制:载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域,如MCS,插在其中的外源DNA片段,能被动的跟着载体一起复制/扩增,就像载体的正常成分一样。(二)都能便利的加以检测: 如载体的药物抗性基因,多是抗生素抗性基因,将受体细胞放在含有该抗生素培养板上培养生长时,只有携带这些抗性基因的载体分子的受体细胞才能存活。(三)都能容易进入宿主细胞中去,也易从宿主细胞中分离纯化出来。4.载体的选择和制备:选择载体主要依据构建的目的,同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因,则要选择合适的表达载体。载体选择主要考虑下述3点:【1】构建DNA重组体的目的,克隆扩增/表达表达,选择合适的克隆载体/表达载体。【2】.载体的类型:(1)克隆载体的克隆能力-据克隆片段大小(大选大,小选小)。如<10kb选质粒。(2)表达载体据受体细胞类型-原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳类细胞表达载体。(3)对原核表达载体应该注意3点:①选择合适的启动子及相应的受体菌;②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位;③表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。【3】载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异,适应目的基因与载体易于链接,不产生阅读框架错位。选用质粒(最常用)做载体的4点要求:①选分子量小的质粒,即小载体(1-1.5kb)→不易损坏,在细菌里面拷贝数也多(也有大载体);②一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束,一般10个以上的拷贝,而严谨型质粒<10个。③必需具备一个以上的酶切位点,有选择的余地;④必需有易检测的标记,多是抗生素的抗性基因,不特指多位Ampr(试一试)。无论选用哪种载体,首先都要获得载体分子,然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割,获得分子,以便于与目的基因片段进行连接。